Registro completo de metadatos
| Campo DC | Valor | Lengua/Idioma |
|---|---|---|
| dc.provenance | Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la UBA | - |
| dc.contributor | Dain, Liliana | - |
| dc.contributor | Taboas, Melisa | - |
| dc.creator | Taboas, Melisa | - |
| dc.date.accessioned | 2018-05-04T22:05:27Z | - |
| dc.date.accessioned | 2018-05-28T16:52:53Z | - |
| dc.date.available | 2018-05-04T22:05:27Z | - |
| dc.date.available | 2018-05-28T16:52:53Z | - |
| dc.date.issued | 2014-09-16 | - |
| dc.identifier.uri | http://10.0.0.11:8080/jspui/handle/bnmm/75133 | - |
| dc.description | Con el nombre de Hiperplasia Suprarrenal Congénita (HSC) se conoce a un conjunto de enfermedades autosómicas recesivas en las que se encuentra afectada la esteroidogénesis adrenal. En el 95% de los casos, la HSC se produce por deficiencia de la enzima 21- hidroxilasa. Esta deficiencia puede manifestarse en forma severa o clásica (FC), o leve o no clásica (FNC). La enzima está codificada por el gen CYP21A2, que se encuentra duplicado y repetido en tándem junto a un pseudogen CYP21A1P con el que comparte 98% de identidad de secuencia. La elevada identidad de secuencia produce que la región sea propensa al alineamiento incorrecto y a la recombinación desigual, como así también a la transferencia de secuencias del pseudogen al gen mediante el mecanismo de conversión génica. La mayor parte de los afectados son compuesto heterocigotas ya que poseen diferentes mutaciones en cada uno de sus alelos. En estos casos, la manifestación clínica de la enfermedad será aquella que se relaciona con el alelo con mayor actividad enzimática. Si bien la mayor parte de los pacientes presentan mutaciones derivadas del pseudogen, hasta la fecha se identificaron más de 240 mutaciones diferentes como causales de la patología. En un trabajo previo de nuestro laboratorio se analizó la presencia de las 10 mutaciones más frecuentes derivadas del pseudogén en pacientes con deficiencia de 21-hidoxilasa de nuestra población. En esta tesis se estudió por secuenciación todo el gen CYP21A2 y su región promotora en muestras de ADN de 87 pacientes (15 FC y 72 FNC) en los cuales restaba determinar el defecto causante de la patología en uno o en ambos alelos del gen. Nuestro análisis reveló la presencia de 12 mutaciones poco frecuentes ya descriptas previamente y 7 mutaciones noveles, 6 en la región codificante y 1 en un sitio aceptor de splicing en el intrón 5. Para todas las mutaciones noveles halladas se analizaron 50 individuos de la población general mediante amplificación de la región de interés y cortes con enzimas de restricción y en ningún caso se halló la presencia de las mismas. Se hallaron asimismo, variantes de secuencias no descriptas previamente en regiones promotoras e intrónicas que se clasificaron como polimorfismos ya sea porque las mismas se observaron también en individuos de la población general, o bien porque no se encuentran en sitios que a priori pudieran afectar el splicing, respectivamente.A los efectos de analizar la implicancia biológica de las mutaciones noveles halladas, se realizaron aproximaciones bioinformáticas y ensayos funcionales. Dado que la proteína CYP21A2 humana no está cristalizada, la misma se modeló mediante herramientas in silico a partir de 18 cristalografías de otras proteínas de la familia CYP. Una vez obtenido el modelo, se analizó la estabilidad de las mutantes aminoacídicas halladas que no generaban corrimiento del marco de lectura. Las predicciones indicaron cambios en la estabilidad y/o carga de la superficie de la proteína que sugerirían un posible efecto deletéreo de las mismas. Para los ensayos funcionales, se realizaron mutagénesis dirigidas sobre un vector que contiene al ADNc de CYP21A2, transfección en células COS-7 y estimación de la expresión de la proteína y de su actividad mediante Western Blot y cromatografía en placa delgada (TLC), respectivamente. En todos los casos, las mutantes presentaron una actividad enzimática residual (AER) entre el 15 y el 50%, que se corresponderían con alelos relacionados a la FNC de la patología. En uno de los pacientes, una de las mutaciones noveles se encontraba en el mismo alelo con otra descripta previamente. Los ensayos funcionales demostraron que si bien las mismas en forma aislada son leves, la presencia de ambas en cis predice un alelo severo con una AER cercana al 2%. Para algunas de las mutaciones puntuales y para la doble mutante se observó una disminución en la cantidad de proteína resultante. Para la mutación en el sitio aceptor de splicing en el intrón 5, los análisis bioinformáticos predijeron la anulación del sitio canónico y la presencia de 2 sitios crípticos de splicing, uno en la mitad del intrón 5 y otro en el exón 6. Para evaluar la eficiencia de splicing in vitro, los estudios funcionales consistieron en la construcción de un minigén mediante amplificación de un fragmento entre el exón 4 y el exón 7 del gen, posterior clonado en un vector de expresión, transfección en células HeLa, HEK-293 e Y-1 y valoración del ARNm obtenido por RTPCR. Los ensayos revelaron que la mutante presentaba un ARNm más corto que la salvaje producto de una deleción de 16 nucleótidos debido a la utilización del sitio críptico de splicing dentro del exón 6. Esta deleción generaría un codón de terminación prematuro que predice un alelo severo relacionado con la FC de la patología. Mediante este estudio, el genotipo se completó en 27 de los 87 pacientes (100% de los pacientes FC y 16,6% FNC). Estos resultados señalarían que es probable que el valor de 17- hidroxiprogesterona (17-OHP) post estímulo con ACTH (test que se realiza para incluir a los pacientes de la FNC), esté sobreestimando la prevalencia de la patología. A los efectos de disciminar si los valores hormonales difieren entre los pacientes FNC totalmente genotipificados y aquellos que no, se compararon los valores hormonales de 17-OHP basal y post estimulación con ACTH, así como los de Dehidroepiandrosterona-sulfato (DHEA-S), Testosterona (T) y Androstenediona (A) de 271 pacientes diagnosticados como FNC. Los mismos fueron agrupados de acuerdo a si poseen los 2 alelos mutados, uno o ninguno. Los resultados obtenidos indican que no hay diferencias significativas entre los grupos estudiados cuando se analizaron los valores de A, T y DHEA-S. Sin embargo, en el caso de 17-OHP basal y post ACTH, se observan diferencias significativas entre aquellos que poseen ambos alelos con mutación y los demás grupos de estudio. Asimismo, se observó que si los pacientes presentaban valores de 17-OHP post ACTH entre 10 (valor hormonal de corte para la inclusión de pacientes) y 20 ng/ml, sólo en el 23% se hallaban los 2 alelos mutados Si el valor hormonal era mayor a 20 ng/ml, el 85% posee ambos alelos con mutación. Por último, analizando los genotipos encontrados en todos los pacientes de nuestra cohorte, ya sea mediante secuenciación o mediante el estudio de las 10 mutaciónes más frecuentes, observamos que en un 97,7% de los pacientes el fenotipo se correspondía con el genotipo hallado. Las principales discordancias se hallaron en pacientes con la mutación p.I172N, ya que la misma se asoció tanto a la forma virilizante simple (VS) como a la forma perdedora de sal. Por otro lado, si bien la mutación p.R356W está altamente relacionada a la forma PS de la enfermedad, un paciente VS presentaba esta mutación en heterocigosis compuesta con otra mutación que predice una enzima sin actividad en el alelo homólogo. Asimismo, en la literatura se describe a la mutación poco frecuente p.H62L como una mutación leve y asociada a la FNC de la patología. En esta tesis, sin embargo, se refiere que la misma se relacionaría también con la forma VS de la enfermedad. Por último, la mutación poco frecuente p.R341P se asocia a la forma VS, si bien en este trabajo se describe un paciente PS que poseía esta mutación en heterocigosis compuesta con la mutación c.283-13A/C>G en el otro alelo. | - |
| dc.description | Congenital Adrenal Hyperplasia (CAH) is an autosomal recessive disease caused, in 95 % of cases, by the deficiency of the 21–hydroxylase enzyme. This disorder, which is the most frequent inborn error of metabolism, has a broad spectrum of clinical forms, ranging from severe or classical, which includes the salt-wasting (SW) and simple virilising (SV) forms, to the mild late onset or non-classical form of CAH (NCCAH). The enzyme is encoded by the CYP21A2 gene, which is duplicated and repeated in tandem along with the CYP21A1P pseudogene with which it shares 98 % of sequence identity. The high degree of sequence identity makes this region prone to misalignment and unequal recombination, as well as the transference of sequences from the pseudogene to the gene by gene conversion. Although most of the patients presented pseudogene derived mutations, approximately 240 mutations haven been described up to date. In this work, DNA from 87 patients (15 CCAH and 72 NCCAH) was analyzed by complete gene sequencing. In these patients the determination of the defect causing the disease remained inconclusive after the study of the 10 most frequent pseudogen-derived mutations. We found 12 less frequent mutations previously described, and 7 novel ones, 6 of them in the coding region and one in an acceptor splice site in intron 5. For all the novel mutations, DNA from 50 randomly selected individuals from the general population were analyzed by PCR amplification followed by restriction enzyme assays, but none of these mutations were found. We also found novel sequence variants in in the promoter region of the gene and in introns that were classified as polymorphisms, either because they were found in individuals from the general population, or because they are placed in regions that might not affect splicing outcome, respectively. In order to study the biological consequences of the novel mutations, bioinformatic approaches and functional assays were performed. Since human CYP21A2 was not crystallized yet, the protein was modeled by means of in silico tools using 18 other CYP proteins as templates followed by the estimation of the mutant protein stability. Molecular modeling studies revealed changes in the stability and/or surface charge of the protein that could be related to the clinical manifestations found in the patients. For functional assays, site-directed mutagenesis of a vector containing the CYP21A2 cDNA were performed, followed by transfection into COS-7 cells and estimation of the protein expression by Western blotting (WB) and its activity by TLC. In all cases, the mutants showed a residual enzymatic activity (REA) lesser than 50% of the wild type protein. Accordingly, all the variants predict alleles compatible to the mild NCCAH form of the disease. In one patient, one of the novel mutations was found in the same allele with another previously described. Functional assays showed that while the mutations in isolation are mild, the presence of both mutations in cis predict a severe allele with a REA close to 2%. In the WB assays, some of the isolated mutants and the double one showed less amount of the protein in comparison with the wild type. For the novel mutation in the acceptor splcing site of intron 5, in silico analyses predicted the disruption of the canonical site. Besides, two strong putative cryptic splicing sites, one located in the intron 5 and one in exon 6 were predicted. For functional assays, splicing reporter minigenes were constructed comprising the genomic region from exon 4 to exon 7 of the CYP21A2 gene. The vector was transiently transfected into HEK-293, HeLa, Y-1 cells and splicing was assessed by RT-PCR. We demonstrate that the allele with the intron 5 mutation completely abolishes the use of the canonical splicing site. Instead, the use of the cryptic splicing acceptor site within exon 6 created an mRNA with a 16 nt deletion leading to the appearance of a premature stop codon. A severe allele related to the classical form of the disease is strongly suggested by this mutation. After our work, the genotype was completed in 27 out of 87 patients (100 % of the CCAH and 16,6% of the NCCAH). This results may indicate that the currently cut-off hormonal levels used for the diagnosis of NCCAH is overestimating the prevalence of the disease. To evaluate if hormone values differ between the NCCAH patients fully genotyped and those with at least one non-determined allele, basal and post ACTH stimulation 17-hydroxyprogesterone (17-OHP), dehydroepiandrosterone-sulfate (DHEA-S), testosterone (T) and androstenedione (A) values were compared in 271 patients diagnosed as NCCAH. Patients were grouped according to whether they had 2 mutated alleles, one or no one. Our analysis revealed no significant differences between groups when the values of A, T and DHEA-S were compared. However, basal and post ACTH 17-OHP levels were statistically different between those patients having both mutated alleles and those with one or no one. Among patients with 17-OHP post ACTH values between 10 (currently cut-off value) and 20 ng/ml, only a 23 % had 2 mutated alleles, whereas if the values were greater than 20 ng/ml, 85 % of patients had mutations in both alleles. Finally, analyzing the genotypes found in all our patients, either after sequencing or by studying the 10 most frequent mutations, we observed a 97,7% phenotype-genotype correlation, while discrepancies were found mostly associated to the p.I172N mutation. Patients having this mutation presented either with the SV form or with the SW one. In addition, while p.R356W mutation is strongly associated with the SW form of the disease, we found the mutation in one patient SV with another severe mutation in the homologous allele. On the other hand, the less frequent p.H62L is described in literature related to the mild NCCAH form. In this work, however, it is reported associated to the SV form of the disease. Finally, the less frequent SV p.R341P mutation, is herein described in a SW patient having the c.283-13A / C> G mutation in the homologous allele. | - |
| dc.description | Fil:Taboas, Melisa. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. | - |
| dc.format | application/pdf | - |
| dc.language | spa | - |
| dc.publisher | Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires | - |
| dc.rights | info:eu-repo/semantics/openAccess | - |
| dc.rights | http://creativecommons.org/licenses/by/2.5/ar | - |
| dc.source.uri | http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5617_Taboas | - |
| dc.subject | CONGENITAL ADRENAL HYPERPLASIA | - |
| dc.subject | 21-HYDROXYLASE DEFICIENCY | - |
| dc.subject | CYP21A2 GENE | - |
| dc.subject | NOVEL MUTATIONS | - |
| dc.subject | FUNCTIONAL STUDIES | - |
| dc.subject | HIPERPLASIA SUPRARRENAL CONGENITA | - |
| dc.subject | DEFICIENCIA 21-HIDROXILASA | - |
| dc.subject | GEN CYP21A2 | - |
| dc.subject | MUTACIONES NOVELES | - |
| dc.subject | ESTUDIO FUNCIONAL | - |
| dc.title | Estudio de mutaciones noveles como causa de la deficiencia de 21-hidroxilasa | - |
| dc.title | Study of novel mutations as the cause of 21-hydroxylase deficiency | - |
| dc.type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis | - |
| dc.type | info:ar-repo/semantics/tesis doctoral | - |
| dc.type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion | - |
| Aparece en las colecciones: | FCEN - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. UBA | |
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