Registro completo de metadatos
| Campo DC | Valor | Lengua/Idioma |
|---|---|---|
| dc.provenance | Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la UBA | - |
| dc.contributor | Téllez-Iñón, María Teresa | - |
| dc.contributor | Santori, María Isabel | - |
| dc.creator | Santori, María Isabel | - |
| dc.date.accessioned | 2018-05-04T22:04:27Z | - |
| dc.date.accessioned | 2018-05-28T16:37:31Z | - |
| dc.date.available | 2018-05-04T22:04:27Z | - |
| dc.date.available | 2018-05-28T16:37:31Z | - |
| dc.date.issued | 2002 | - |
| dc.identifier.uri | http://10.0.0.11:8080/jspui/handle/bnmm/73895 | - |
| dc.description | En nuestro laboratorio se clonaron dos CRKs (CDK1 Related Kinases) de T. cruzi, TzCRK1 y TzCRK3 (Gómez y col., 1998) y se identificaron, por doble híbrido, proteínas que se asocian a TzCRK1 con similitud a una familia de ciclinas (Gómez y col., 2001). En el presente trabajo de tesis se caracterizaron y clonaron proteínas candidatas a participar en el control del ciclo celular de T. cruzi. Se secuenciaron en su totalidad los fragmentos de los genes obtenidos por doble híbrido y se los denominó TzCYC4, TzCYC5 y TzCYC6. Además se clonaron los genes completos y se secuenciaron. La secuencia predicha para las tres proteinas mostró similtud con ciclinas denominadas PHO, presentes en S. cerevisiae. TzCYC5 posee una región rica en histidinas próxima al amino terminal. Se determinó que los tres genes son de copia única mediante Southern blot y por rastreo de una biblioteca genómica. La expresión de los tres genes mostró variaciones particulares en distintos estadios de T. cruzi. TzCYC6 complementó una cepa mutante de S. cerevisiae, deficiente en las ciclinas de G1, demostrando que es una ciclina funcional. Se determinó el patrón de expresión de TzCRK3 en estadíos de T. cruzi. El ARNm de TzCRK3 es más abundante en el estadío amastigotes que en epimastigotes o tripomastigotes. Se obtuvo un suero específico contra TzCRK3, inmunizando conejos con la proteína recombinante expresada en bacterias. Ensayos de Western blot mostraron, en epimastigotes la presencia de una proteína del peso molecular esperado, 35 kDa. En amastigotes y tripomastigotes, se observaron bandas específicas de menor movilidad. Se estableció que la proteina identificada en epimastigotes se asocia a p13ˢͧͨ¹-agarosa, proteína con alta afinidad por CDK1. TzCRK3 endógena mostró actividad quinasa de histona H1 y fue inhibida por inhibidores de CDKs: flavopiridol, roscovitina y olomoucina. Flavopiridol inhibió el crecimiento de epimastigotes en cultivo, aunque no en forma total. La actividad quinasa de la TzCRK3 de dichos epimastigotes se inhibió en forma dosis dependiente. La actividad de quinasa de histona H1 asociada a p13ˢͧͨ¹ mostró las mismas variaciones estadío especificas y similar sensibilidad a los CK1s que TzCRK3. En los cultivos con flavopiridol el IC50 no mostró diferencias significativas con el de TzCRK3. La actividad de TzCRK3 en epimastigotes sincronizados mostró un pico en G2/M mientras que la actividad asociada a p13ˢͧͨ¹ aumentó al mismo tiempo pero no disminuyó hasta M. La expresión de TzCRK3 fue constante. Los patrones de actividad y expresión de TzCRK3 son tipicos de una CDK. Esta evidencia indica que TzCRK3 está involucrada en el control del ciclo celular de T. cruzi, controlando el pasaje de G2/M, aunque no se puede excluir la presencia de otra CDK. Se identificó un EST con alta similitud de secuencia con Lmmp12ͨᴷˢ¹, el gen homólogo a p13ˢͧͨ¹ en Leishmania mexicana. Se clonó el gen completo y se determinó que es copia única. La secuencia esperada de la proteína muestra una alta identidad de secuencia con la familia de proteinas CKS. Su expresión mostró variaciones estadío especificas. La proteina recombinante se expresó en bacterias, en fusión a histidinas, se la purificó y se inmunizaron conejos para obtener un anti suero. | - |
| dc.description | In our laboratry two CRK genes: TzCRK1 and TzCRK3 from T. cruzi were previously isolated (Gómez et al., 1998), and using the yeast two-hybrid system open reading frames coding for proteins able to associate with TzCRK1 were identified (Gómez et al, 2001). Positive clones obtained in the two hybrid screen were sequenced and compared in data banks. Clones sharing identity with S. cerevisiae PHO cyclins were named TzCYC4, TzCYC5 y TzCYC6. Full lenght genes were cloned and sequenced. Identity with proteins from the PHO family was still observed when the predicted aminoacidic sequences were compared. An histidine-rich domain was observed in the TzCYC5 amino terminal region. All three genes were shown to be single copy. Cyclins mRNA levels varied in a stage specific manner. TzCYC6 was able to functionally complement a S. cerevisiae deficient for G1 cyclins. To establish if TzCRK3 has a role in the regulation of the parasite cell cycle, its expression and activity were studied. Northern and Western blot analyses detected the enzyme in three forms of the parasite; mRNA levels, subcellular localization and apparent molecular weight of the protein varied throughout the stages. TzCRK3 from epimastigote soluble extracts interacted with p13ˢͧͨ¹-beads. Endogenous TzCRK3 phosphorylated histone H1 and this activity was inhibited by specific CDK inhibitors (CKIs): olomoucine, flavopiridol and roscovitine. In addition, p13ˢͧͨ¹ beads coprecipitated with a kinase activity that was inhibited by the CDK inhitors mentioned above. Flavopiridol partially inhibited the growth of T. cruzi epimastigotes at 50 nM, the lowest concentration used, but even with the highest (5 mM), cell growth was not completely arrested. TzCRK3 from flavopiridol inhibited epimastigotes extracts exhibited a dose dependent inhibition of histone H1 phosphorylation. T. cruziˢͧͨ¹- binding CRK displayed the same inhibition profile. TzCRK3 IC50 did not significatively differed from the shown by the kinase activity associated to p13ˢͧͨ¹. This indicates that TzCRK3 is the enzyme responsible for the majority of the kinase activity associated to p13ˢͧͨ¹. TzCRK3 activity of hydroxyurea (HU) synchronized epimastigotes peaked in G2/M boundary while the kinase activity associated to p13ˢͧͨ¹ beads increased at the same time point but remained high until late G2/M. In addition, TzCRK3 expression was constant along the cell cycle. This is a common pattern of CDK activity regulation. Taken together, these results contribute to support the idea that TzCRK3 is involved in control of the cell cycle in T. cruzi. A T. cruzi EST sharing high identity values with the Leishmania mexicana p13ˢͧͨ¹ homologous, Lmmp12ͨᴷˢ¹ was identified. The full lenght gene was cloned. The predicted aminoacidic sequence showed high identity scores with proteins belonging to the CKS family. This protein was named Tzp12ͨᴷˢ¹. mARN levels in different stages of the parasite varied. The recombinant protein, fused to a histidine tag, was expressed in bacteria. It was purified and used to immunize rabbits, in order to obtain a specif antibody. | - |
| dc.description | Fil:Santori, María Isabel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. | - |
| dc.format | application/pdf | - |
| dc.language | spa | - |
| dc.publisher | Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires | - |
| dc.rights | info:eu-repo/semantics/openAccess | - |
| dc.rights | http://creativecommons.org/licenses/by/2.5/ar | - |
| dc.source.uri | http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3504_Salio | - |
| dc.title | Clonado y caracterización de proteínas relacionadas al control del ciclo celular del parásito Trypanosoma cruzi | - |
| dc.type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis | - |
| dc.type | info:ar-repo/semantics/tesis doctoral | - |
| dc.type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion | - |
| Aparece en las colecciones: | FCEN - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. UBA | |
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